熒光壽命測量原理

熒光壽命是衡量一個熒光基團激發(fā)態(tài)通過發(fā)射光子回到基態(tài)的時間。熒光壽命的范圍可以從皮秒到幾百納秒。下面列出一些常見物質(zhì)的的熒光強度和熒光壽命。

一個處于激發(fā)態(tài)的物質(zhì)，當其返回基態(tài)，光子數(shù)衰減到原來的1/e，或36.8%，所經(jīng)歷的時間即為熒光壽命：

如熒光強度衰減圖（圖1）所示，熒光壽命t是熒光強度衰減到原來1/e的時間。熒光強度與衰減時間的函數(shù)：

I（t）是指時間為t時的熒光強度，α是一個標準系數(shù)，τ是時間壽命。

了解熒光壽命的基本理論對于理解利用熒光壽命進行定量分析的方法是非常重要的。

目前測定熒光強度的方法主要有“時域法”和“頻域法”兩種。

時域法

所謂時域法，就是一定發(fā)射強度的短脈沖光照射樣品，并記錄時間。短脈沖光以前使用的是閃光燈，分辨率可以達到幾個納秒。現(xiàn)在用的是激光光源，分辨率可以達到皮秒或更短。

圖1。表示的短脈沖光激發(fā)下的熒光熒光的衰減圖。

如果用場波長的激發(fā)光激發(fā)，熒光強度和壽命是一個單指數(shù)關(guān)系，這時壽命可以也可以用曲線的斜率直接測定。如果壽命時間和激發(fā)脈沖光的分辨率比較接近，計算時間壽命必須去除“堆積”效應(yīng)。

我們正努力數(shù)學(xué)的方法研究“反堆積”對激發(fā)脈沖光的影響?？梢钥吹降臒晒馑p的曲線形狀（見許多章節(jié)[ 2 ]）。目前，隨著告訴脈沖激光的出現(xiàn)，這些“反堆積”過程對于大多數(shù)壽命測量已經(jīng)變得不那么重要了，盡管它們?nèi)匀淮嬖凇y量時，可以使用與壽命時間相當?shù)墓饷}沖。

頻域法

頻域法的原理是：

E(t)and E0分別是時間在t和0的熒光強度，ME是調(diào)制系數(shù)，
是光束的調(diào)制頻率，圖二顯示的是熒光強度和熒光壽命時間的關(guān)系。

圖2 藍色是激發(fā)光譜，紅色是熒光光譜，可以顯示它相對于激發(fā)光譜的相位偏移

熒光多相位解頻的公式如下：

相位移：

這兩種關(guān)系都與衰變時間τ有關(guān)，用儀器測量解調(diào)系數(shù)和相位，在不同的調(diào)制頻率偏移（通常為15-20），數(shù)據(jù)對理論模型進行擬合。因此利用相移和相對調(diào)制可以確定全程相位τP和全程調(diào)制τM.，如果熒光衰減是單指數(shù)，然后τP和τM將取決于調(diào)制頻率。

τP和τM和的差異主要是頻率形式，即分析方法基礎(chǔ)上的差異，包括壽命和振幅。

必須注意區(qū)分總強度f從到α的影響度，即之前說的時間域。這兩個術(shù)語之間的關(guān)系是由：

其中J代表所有成分的總和，α指前因子，τ是這些物質(zhì)的壽命。

分析

多頻相位和調(diào)制數(shù)據(jù)通常用非線性小二乘法進行分析，其中實際相位和調(diào)制率數(shù)據(jù)（不是壽命值）適合于單個或多個指數(shù)衰減的不同模型。

擬合的質(zhì)量是通過減少的卡方值判斷

除了使用離散指數(shù)衰減模型進行衰減分析外，還可以選擇將數(shù)據(jù)擬合到分布模型。在這種情況下，假定發(fā)射態(tài)的激發(fā)態(tài)衰減特性實際上導(dǎo)致了大量壽命分量。下面是一個典型的壽命分布圖。單色氨酸含蛋白-人血清白蛋白。

圖三所示為頻率響應(yīng)曲線（相位和調(diào)制率VS 調(diào)制頻率）。人血清蛋白HAS在激發(fā)光源LED300nm，下，使用長通320nm濾片在20℃收集發(fā)射信號。使用洛倫茲變換擬合數(shù)據(jù)（中心點5.4ns，寬度2.9ns，分布98%）和另一個離散擬合數(shù)據(jù)部分（t=0.51ns，分布0.02%）。這里顯示的分布是Lorentzian，而是取決于系統(tǒng)的衰減動力學(xué)，不同類型的分布，如高斯，或不對稱分布（普朗克），可以利用。本文描述了壽命分析的方法。

應(yīng)用

熒光壽命的測定

熒光壽命是表征熒光物質(zhì)和熒光性質(zhì)的重要手段。蛋白質(zhì)的生物物理研究，例如特定的氨基酸殘基之間的距離由福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。此參數(shù)主要不受內(nèi)部過濾效果，靜態(tài)淬火和熒光基團的濃度變化的影響。因此有利于臨床和高通量篩選（HTS）應(yīng)用于鑒別生物樣品高背景熒光的應(yīng)用。

另外，這個參數(shù)在多路復(fù)用方面提供了更多的優(yōu)勢。區(qū)分兩個熒光基團的能力，具有相似的光譜但不同的壽命是另一種增加測量參數(shù)的方法，例如[ 5 ]。可以利用幾種機制來開發(fā)基于壽命的分析方法。有簡單的結(jié)合分析，在結(jié)合2部分組成（一個被熒光標記）是伴隨著參數(shù)的變化。另一種情況是猝滅釋放型分析，淬滅的物質(zhì)有低但有限的熒光，但初存在大量過剩。如果熒光化合物被釋放（與互補的DNA鏈結(jié)合）（分子信標）或酶促反應(yīng)）系統(tǒng)的壽命增加。熒光共振能量轉(zhuǎn)移分析中能量傳遞效率的測量方法，為避免供體和受體之間的光譜重疊問題，可以采用非熒光受體。

熒光壽命的測量

目前使用的大多數(shù)熒光傳感器和檢測都是基于強度測量的。雖然這些方法更容易實現(xiàn)，但是需要頻繁校準[ 6 ]。許多基于強度的測量相關(guān)的難點，是可以規(guī)避使用壽命為基礎(chǔ)的基于壽命的測量，具有與熒光無關(guān)的優(yōu)點。在過去的10年中，許多研究顯示了分析物敏感的熒光壽命的變化。鑒定和特征。其中一些探針列于表2中。關(guān)于基于生命周期的詳細討論監(jiān)測我們參考你在[ 6 ]章節(jié)的“終身監(jiān)測”章節(jié)。

熒光壽命成像

在熒光顯微鏡下測量探針濃度，也為熒光壽命也提供了新的機會。熒光圖像的對比度是建立在每一對探針的熒光壽命的創(chuàng)建圖像點。典型的例子是細胞參數(shù)的映射，如pH值、離子濃度或氧。熒光猝滅，熒光共振能量轉(zhuǎn)移，光子誘導(dǎo)能飽和轉(zhuǎn)移（寵物）。生命成像技術(shù)的生物學(xué)應(yīng)用的例子包括組織表面的掃描，光動力療法，DNA芯片分析，體貌成像和其他（見例[ 7 ]）。